03 DNA 바코드 기술
DNA 바코드의 개념은 슈퍼마켓 상품 스캐닝과 유사합니다. 생물학적 DNA의 특정 영역에서 서열을 분석하여 종을 식별합니다.곰팡이의 경우 국제적으로 인정 된 표준 바코드 지역은 (내부 전사 스페이서)입니다.이 기술은 수십 년 동안 미화 학자들을 괴롭힌 문제를 해결할뿐만 아니라 현장 수집가, 요리사 및 연구원들에게 전례없는 정확한 도구를 제공합니다.
그것의 18S-5.8S-28S 리보솜 DNA 유전자 사이에 위치하고 있으며, 2 개의 스페이서 인 ITS1과 ITS2를 함유한다.곰팡이 표준 바코드 영역으로 선택하는 것은 네 가지 주요 장점을 기반으로합니다.
이상적인 변화 : 그 지역은 상대 종을 구별하기 위해 종들 사이에 충분히 큰 차이를 가지고 있지만, intraspecies 변이는 비교적 작으므로 동일한 종의 개별 서열이 기본적으로 일관되도록합니다.실제 데이터에 따르면 대부분의 곰팡이 집단에서 종마다 3-15%가 변하는 반면, intraspecies 변동은 일반적으로 1-2% 미만입니다.
일반 프라이머 : 연구원들은 각 종에 대한 특정 프라이머를 설계 할 필요없이 대다수의 곰팡이 집단의 영역을 증폭시킬 수있는 여러 쌍의 범용 프라이머 (예 : ITS1/ITS4, ITS5/ITS)를 개발했습니다.
Domain Rich : 전 세계의 Mycologists는 Unite, Genbank 및 Bold Systems와 같은 수백만 개의 시퀀스를 포함하는 데이터베이스를 공동으로 구축하여 비교 및 식별을위한 견고한 토대를 제공했습니다.
증폭력 : 그 영역의 길이는 중간 정도 (일반적으로 500-700베이스 쌍)를 가지며 PCR 증폭 성공률이 높으며, 이용 가능한 서열은 분해 된 샘플로부터도 얻을 수 있습니다.
태평양 북서부에서는 수집가들이 DNA 바코드가 실제로 죽음의 캡에 가까운 새로운 종 (Amanita Phalloides)이라는 것을 밝혀 질 때까지 수년 동안 식용 종으로 흰색 아마니타를 사용했습니다.이 발견은 수많은 중독 사건을 방해했을 수 있습니다.연구자들은 서열 분석을 통해이 버섯이 알려진 식용 아마니 타와 8.7% 다르다는 것을 발견했으며, 이는 종 등급 차별 임계 값 (보통 3%)보다 훨씬 높았다.
수집 도구 준비 :
- 멸균 장갑 (교차 오염 방지)
- 멸균 샘플링 백 또는 종이 백
- 휴대용 냉장고 (DNA 무결성 유지)
- GPS 장비 (정확하게 획득 지점을 배치)
- 디지털 카메라 (매크로 기능 기록)
- 현장 기록부 (레코드 서식지, 호스트, 냄새 등)
전문가 추천 : STEM의 기초를 포함하여 수집 중에 완전한 과일 바디를 유지하십시오. 많은 주요 식별 기능이 여기에 있습니다.이상적으로, 여러 발달 단계의 개인이 수집되며, 완전히 성숙 할 때까지 우산을 열지 않습니다.
샘플 저장 방법 :
- 실리콘 젤 건조 방법 : 신선한 샘플을 밀봉 된 용기에 넣고 실리콘 입자와 혼합 한 다음 48 시간 이내에 완전히 건조시킵니다.
-Cryo 저장소 : 장기 저장 용 -20 ° C, -80 ° C 최고
- 에탄올 보존 : 95% 에탄올은 분자 연구에 적합하지만 형태 학적 특성을 파괴 할 것입니다.
기본 가정 실험실 프로그램 :
1. 건조 된 박테리아 캡 조직 50-100mg을 섭취하여 액체 질소로 미세 분말로 분쇄하십시오.
2. CTAB 추출 완충액을 추가하고 65 ° C에서 30 분 동안 목욕을합니다.
3. 단백질을 제거하기위한 클로로포름-이소 아밀 알코올 추출
4. 이소 프로판올은 DNA를 침전시킨다
5. 70% 에탄올로 세척하고 TE 완충액에 용해
상용 키트 선택 : 초보자의 경우 Qiagen Dneasy Plant Mini Kit 또는 MP Biomedicals FastDNA 스핀 키트를 사용하는 것이 좋습니다.
일반적인 오류 회피 :
- 오래된 샘플 또는 저하 된 샘플을 사용하지 마십시오
- 외인성 DNA 오염 방지 (워크 벤치, 도구 멸균)
- 과도하게 말하지 말고 DNA 파손을 유발하십시오
표준 증폭 체계 :
-프라이머 선택 : ITS1F (5'-CTTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3 ') 및 ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATGC-3')
- 반응 시스템 : 약 10-50 ng 템플릿 DNA를 함유 한 25 μl 총 부피
- 사이클 조건 : 4 분 동안 94 ° C 사전 저작물; 35 사이클 (94 ° C 30 초, 52 ° C 30 초, 72 ° C 45 초); 72 ° C 최종 연장 7 분
시퀀싱 선택 :
-Sanger 시퀀싱 : 단일 샘플, 비용은 약 $ 10-15, 처리 시간 1-3 일
- 고 처리량 시퀀싱 : 환경 샘플 또는 배치 식별에 적합한 비용은 처리량에 따라 다릅니다.
기본 프로세스 :
1. 시퀀스 품질 관리 : 저품질 영역을 제거하고 Q 값> 30
2. Blast Search : NCBI 또는 Unite 데이터베이스의 비교
3. 유사성 평가 :> 97-99% 유사성은 일반적으로 동일한 종을 나타냅니다.
4. 계통 발생 학적 분석 : 진화 트리를 구성하여 식별 결과 확인
실용 기술 : 가장 높은 일치 결과를 맹목적으로 믿지 마십시오.다수의 높은 매칭 시퀀스를 점검하여 기원과 주석 품질을 확인하십시오.Unite 데이터베이스에서 "종 가설"숫자를 갖는 시퀀스가 선호되며, 이는 전문적으로 주석이 달성되고 신뢰성이 높습니다.
Unite Database (https://unite.ut.ee)
- 곰팡이의 시퀀스를 위해 특별히 설계되었습니다
- 오류 식별을 줄이기 위해 종 가정 (SH) 시스템을 제공합니다.
- 기본 식별 리소스로 권장됩니다
GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)
- 모든 생물학적 서열을 포함하는 포괄적 인 데이터베이스
- 데이터 볼륨은 크지 만 품질은 다르므로주의해서 사용해야합니다.
- 폭발 도구와 함께 최상의 효과
굵은 시스템 (http://www.boldsystems.org)
- DNA 바코드 용으로 특별히 설계되었습니다
- 형태 학적 및 분자 데이터를 통합합니다
- 초보자에게 적합한 사용자 친화적 인 인터페이스
멀티-다타베이스 검증 : 중요한 인증은 적어도 두 개의 독립적 인 데이터베이스에서 확인해야합니다.Unite and Bold가 동일한 결과를 제공하면 신뢰성이 크게 향상됩니다.
시퀀스 품질 평가 :
- 시퀀스 길이를 확인하십시오 (전체 영역이> 500bp 여야 함)
- 제출자의 신뢰성 확인 (연구 조직 vs 검증 된 사용자)
- 관련 게시 된 문헌 지원을보십시오
LSU (큰 서브 유닛 리보솜 RNA) :
- 레벨 이상의 분류 단위의 분류에 적합
- 진화율은 느리고 먼 관계 연구에 적합합니다.
- 특히 효모 및 미세균 식별에 사용됩니다
TEF1-α (번역 연장 계수) :
- 난초 난초와 같은 특정 그룹에서 더 높은 종 수준의 해상도
- 구별 할 수없는 가까운 친척의 문제를 해결
- 그룹 별 프라이머가 필요합니다
RPB2 (RNA 폴리머 라제의 두 번째로 큰 서브 유닛) :
- 계통 발생 학적 연구에 선호되는 마커 중 하나
- 그것과 다른 진화 신호를 제공합니다
- 일반적으로 분류 시스템 개정에 사용됩니다
어려운 식별을 위해 여러 유전자 마커를 결합하면 정확도가 크게 향상됩니다.표준 다중 유전자 분석에는 ITS+LSU+RPB2+TEF1-α가 포함되며,이 조합은 상대 종의 구별에서 거의 100%의 성공률을 갖는다.
사례 연구 : 북미 모렐 단지
전통적으로 북미 수집가들은 모든 검은 색 모렐을 같은 종으로 간주합니다.DNA 바코드는 이것이 실제로 12 종의 복합체이며, 그 중 일부는 분포 범위가 제한되어 있으며 수집 응력은 국소 멸종으로 이어질 수 있음을 보여줍니다.책임 있고 전문적인 수집가는 이제 지속 가능한 수집을 보장하기 위해 고 부가가치 종의 DNA 검증을 수행합니다.
고객 버섯 제품 진정성 검증
실험실 테스트에 따르면 시장에 나와있는 "야생 수집 된"버섯의 30%가 실제로 품종이라는 것을 발견했습니다.DNA 바코드를 사용하여 공급 업체의 진술의 진위를 확인할 수 있습니다.특히 Matsutake, Morel 및 Chanterelles와 같은 고 부가가치 종에 적합합니다.
혁신적인 기술 : 토양, 물 또는 공기에서 총 DNA를 추출하고 과일 개체를 배양하거나 관찰하지 않고 고 처리량 시퀀싱을 통해 곰팡이 커뮤니티 구성을 분석하십시오.
실제 응용 프로그램 :
- 멸종 위기 종의 분포의 변화 모니터링
- 침습성 곰팡이 종의 조기 검출
- 산림 생태계 건강 평가
- 곰팡이 지역 사회에 대한 기후 변화의 영향 추적
실외 운영 안내서 :
1. 100-200g의 지표 토양 수집 (잎 층 제거)
2. 멸균 도구를 사용하여 교차 오염을 피하십시오
3. 즉시 냉장 또는 스토리지 버퍼를 추가하십시오
4. 정확한 GPS 좌표 및 환경 매개 변수를 기록하십시오
유독 한 버섯 중독의 경우, DNA 분석은 구토, 요리 잔류 물 및 소화 시스템의 종을 식별하여 의학적 개입에 대한 주요 정보를 제공 할 수 있습니다.2019 년 캘리포니아 중독 사건에서 Amanita Phalloides는 DNA 바코드를 통해 위의 내용물에서 확인되었으며, 의사는 실험적인 해독제를 사용하여 환자의 생명을 성공적으로 구할 수 있도록 안내되었습니다.
옥스포드 나노 포어 미니언 :
- 팜 시퀀서, USB를 통해 노트북에 연결되었습니다
- 실시간 시퀀싱, 데이터 수집은 샘플 준비 후 몇 분 안에 시작됩니다.
- 실외 워크 스테이션에 적합합니다
- 비용 : 스타터 키트 약 $ 1,000, 시퀀싱 당 비용은 계속 감소합니다.
빠른 PCR 장치 :
- 휴대용 PCR 기기, 배터리 전원
- 30 분 이내에 확장을 완료하십시오
- 스마트 폰 애플리케이션과 연결하여 운영 프로세스를 단순화하십시오
1. 현장 샘플 수집 및 기록
2. 빠른 DNA 추출 (15 분)
3. 휴대용 PCR 증폭 (30 분)
4. 미니언 시퀀싱 및 실시간 분석 (1-4 시간)
5. 위성 네트워크를 통한 액세스 데이터베이스 비교
실제 경험 : 몬태나 외곽 지역의 곰팡이 조사 에서이 시스템을 사용하여 3 시간 안에 12 개의 샘플의 현장 식별을 완료했으며 전통적인 방법은 몇 주가 걸렸습니다.
비즈니스 서비스 (샘플 보내기) :
- 단일 샘플 Sanger 시퀀싱 : $ 15-40
- 샘플 준비 + 시퀀싱 : $ 50-100
-고 처리량 시퀀싱 (샘플 당) : $ 10-25 (배치)
셀프 서비스 계획 :
- 실험실 장비에 대한 초기 투자 : $ 5,000-10,000 (PCR 기기, 전기 영동 장비 등 포함)
- 반응 당 소모품 비용 : $ 5-15
- 대학 협력 : 많은 연구 기관이 시민 과학 샘플을 받아들이고 비용이 크게 낮습니다.
DNA 시퀀싱 비용은 지난 10 년 동안 2008 년 메가베이스 당 0.10 달러에서 2023 년에 0.0001 달러로 1,000 배 감소했습니다.이 추세는 계속되며 개별 곰팡이 식별 비용은 향후 5 년간 시간당 5 달러 이하로 떨어질 것으로 예상됩니다.
INTERALIST 플랫폼 :
1. 명확한 버섯 사진을 업로드하십시오
2. 자세한 수집 정보를 기록하십시오
3. 예비 공동체 평가를 얻으십시오
4. DNA 분석을 제출하려면 고품질 관찰을 선택하십시오
전문 프로젝트 협력 :
-NSF 자금 지원“북미 곰팡이 다양성 프로젝트”
- 다양한 장소의 곰팡이 사회에 대한 특별 연구
- 대학 연구 팀의 시민 과학 프로그램
샘플 제출 계약 :
- 연구원에게 연락하여 관심사와 요구를 확인하십시오
- 샘플 수집 및 보존 가이드를 따르십시오
-자세한 현장 데이터 및 고품질 사진을 제공하십시오
- 데이터 공유 및 출판에 동의합니다
시민 과학자들의 공동 노력을 통해이 프로젝트는 지난 5 년간 5,000 개 이상의 지리 회의 샘플을 수집하고 23 개의 새로운 곰팡이 종을 발견하고 23 속의 분류 경계를 수정했으며 기후 변화가 곰팡이 현상에 미치는 영향에 대한 주요 데이터를 제공했습니다.
불완전한 데이터베이스 :
- 곰팡이 종의 10-15%만이 참조 서열을 가지고있는 것으로 추정됩니다.
- 심각하게 저조한 열대 및 지하 곰팡이
- 오류 주석 시퀀스는 데이터베이스를 오염시킵니다
유형 내 돌연변이 문제 :
- 일부 그룹에서는 변형이 크다 (예 : Ectomycorrhizal 곰팡이).
- 단일 바코드는 모든 종을 구별 할 수 없습니다
- 추가 분자 마커 확인이 필요합니다
자원 요구 사항 :
- 초기 기술 임계 값이 높습니다
- 분자 생물학에 대한 기본 지식이 필요합니다
- 샘플 오염의 위험은 항상 존재합니다
식별 트랩 :
- 블라인드 트러스트 데이터베이스 최고 일치
- 형태와 생태 데이터를 무시하십시오
- 부정적인 결과의 과잉 설명
전체 게놈 시퀀싱 :
- 비용은 계속 감소하고 더 많은 참조 게놈
- 바코드를 훨씬 뛰어 넘는 많은 정보를 제공합니다.
- 복잡한 분류 문제를 해결하십시오
인공 지능 통합 :
- 기계 학습 자동 시퀀스 분석 및 품질 관리
- 이미지 인식 + DNA 데이터 공동 식별
- 예측 분포 모델링
현장 기술 :
- 스마트 폰 연결 휴대용 시퀀싱 장치
- 실시간 데이터베이스 액세스 및 비교
- 증강 현실 인터페이스 가이드 컬렉션
글로벌 이니셔티브 :
- 통합 바코드 방법 및 데이터 표준
- 참조 시퀀스 품질 인증 시스템
- 형태 및 분자 데이터 통합 플랫폼
1 단계 : 기본
- 온라인 분자 생물학 과정 (Coursera, EDX)
- 지역 곰팡이 협회 워크샵
- 기본 실험실 안전 교육
2 단계 : 기술 개발
- DNA 바코드 교육 워크숍에 참여하십시오
- 자원 봉사자들은 연구 프로젝트에 참여합니다
- 홈 실험실에서 기본 기능을 설정하십시오
3 단계 : 전문 응용 프로그램
- 개인 연구 프로젝트를 수행하십시오
- 시민 과학적 발견을 출판하십시오
- 새로운 세대의 곰팡이 애호가를 안내하십시오
연구 자료 :
- "곰팡이 분자 시스템"(교과서)
- "DNA 바코드 : 원리 및 응용 프로그램"
-이 자연주의 곰팡이 식별 안내서
실험실 장비 :
- 미세 원심 분리기 ($ 200-500)
-PCR 기기 ($ 1,000-3,000)
- 전기 영동 장비 ($ 200-500)
-Pipepter Set ($ 300-600)
소모품 :
- DNA 추출 키트
-PCR 프라이머 및 마스터 믹스
- 아가 로스 및 전기 영동 완충액
- 멸균 소모품 (튜브, 흡입 헤드 등)
지속 가능한 연습 :
- 지역 수집 규정 및 한도를 준수합니다
- 희귀하고 멸종 위기에 처한 종을 피하십시오
- 컬렉션 볼륨이 커뮤니티의 1/3을 초과하지 않습니다.
- 비정상적인 발견을 기록하고보고합니다
데이터 공유 :
- 고품질 시퀀스를 공개 데이터베이스에 제출하십시오
- 수집 정보 및 식별의 정확한 라벨링
- 원주민의 지식과 권리를 존중하십시오
정확한 식별 :
- 발견의 중요성에 대한 과장이 없습니다
- 식별의 불확실성을 인식하십시오
- 피어 검증 어려운 샘플을 찾으십시오
- 잘못된 데이터 및 식별을 수정하십시오
DNA 바코드는 전통적인 균학을 대체하는 것이 아니라 그들과 강한 시너지 효과를 형성하는 것입니다. 가장 신뢰할 수있는 식별은 여러 증거 통합에서 비롯됩니다.
포괄적 인 평가 계약 :
1. 현장 매크로 관찰 및 기록
2. 마이크로 기능 검증
3. 생태 및 분산 데이터 평가
4. DNA 바코드 확인
5. 필요한 경우 화학 분석을 지원합니다
** 전문가들은 제안 : 가장 진보 된 DNA 기술을 사용하더라도 형태 학적 식별 기술을 키우는 것을 무시하지 마십시오.최고의 마이 클리어 전문가는 실험실 데이터와 현장 관찰 경험을 원활하게 결합 할 수있는 사람들입니다.
일주일의 액션 아이템 :
1. 3 개의 일반적인 현지 버섯을 선택하고 자세한 사진을 찍습니다.
2. Inaturalist에서 계정을 만들고 관찰을 업로드하십시오.
3. 지역 곰팡이 사회의 DNA 바코드 프로젝트 연구
4. 기본 곰팡이 분자 생물학에 관한 책을 주문하십시오
이번 달 목표 :
1. 온라인 또는 오프라인 DNA 바코드 세미나에 참여하십시오
2. 샘플 수집 및 보존 시스템을 설정하십시오
3. 지역 대학 Mycology Research Group에 문의하십시오
4. 가정용 실험실 예산 및 계획을 준비하십시오
올해의 비전 :
1. 최소 50 개의 토착 종 DNA 바코드를 완료하십시오
2. 시민의 과학적 발견에 관한 보고서를 발표하십시오
3. 개인 참조 시퀀스 라이브러리를 만듭니다
4. DNA 바코드 기술을 배우도록 최소한 한 사람을 안내합니다.
DNA 바코드 기술은 곰팡이 식별을 위해 민주화되어 신분을 진지하게 받아들이는 모든 사람에게 전문 실험실로 한 번 제한됩니다.이 기술은 빠르게 발전하고 있으며 비용은 계속 감소하고 접근성이 증가하고 있습니다.지금은 깊이 배우고 DNA 바코드를 mycology 연습에 통합하기에 완벽한시기입니다.
목표는 자연적인 관찰의 즐거움을 기술로 대체하는 것이 아니라 곰팡이 왕국과의 관계를 심화시키고 식별 신뢰를 향상 시키며 글로벌 곰팡이 지식 시스템에 기여하는 것입니다.신중하게 수집, 신중하게 기록 및 정확하게 식별 된 모든 샘플은 과학에 대한 귀중한 기여입니다.