03 なぜDNAの識別が菌学的に変化しているのか

手持ちのDNAシーケンサーを備えた森のキノコを最初に特定したとき、私は菌類学のゲームルールが完全に変化したことに気付きました。伝統的に、私たちは、キャップの色、折り畳みの間隔、リングの形態の形態学的特性に依存しています。現在、DNAバーコードテクノロジーにより、専門家の識別の正確性を達成することを学ぶことに真剣に取り組んでいる愛好家は、専門家の識別に近い愛好家になります。

DNAバーコードの概念は、スーパーマーケットの商品スキャンに似ています。生物学的DNAの特定の領域でシーケンスを分析することにより、種を識別します。菌類の場合、国際的に認識されている標準バーコード領域は（内部転写スペーサー）です。このテクノロジーは、数十年にわたって菌学者を悩ませてきた問題を解決するだけでなく、フィールドコレクター、シェフ、研究者に前例のない正確なツールを提供します。

リボソームDNAの18S-5.8S-28S遺伝子の間に位置し、ITS1とITS2の2つのスペーサーが含まれています。真菌の標準バーコード領域としてそれを選択することは、4つの重要な利点に基づいています。

理想的なバリエーション：その領域は、相対種を区別するために種の間に大きな違いを持っ​​ていますが、種内変動は比較的小さく、同じ種の個々のシーケンスが基本的に一貫していることを保証します。実際のデータは、その領域がほとんどの真菌集団で種間で3〜15％変化することを示していますが、通常、種内変動は1〜2％未満です。

一般的なプライマー：研究者は、各種に特定のプライマーを設計する必要なく、真菌集団の大部分の領域を増幅できる普遍的なプライマー（ITS1/ITS4、ITS5/ITS4など）の複数のペアを開発しました。

ドメインリッチ：世界中のMycologistsは、Unite、Genbank、Bold Systemsなどの数百万のシーケンスを含むデータベースを共同で構築し、比較と識別のための強固な基盤を提供しています。

増幅が簡単：その領域は中程度の長さ（通常は500〜700塩基対）であり、PCR増幅の成功率は高く、劣化したサンプルからも利用可能なシーケンスを取得できます。

###実用的なケース：北米でのアマニタの識別におけるブレークスルー

太平洋岸北西部では、コレクターは長年にわたって白いアマニタを食用種として使用し、DNAバーコードが実際には死のキャップに近い新しい種であることを明らかにしました（アマニタ・ファロイド）。この発見は、多数の中毒事件を妨げている可能性があります。シーケンス分析を通じて、研究者は、このキノコが既知の食用アマニタとは8.7％異なることを発見しました。

###サンプルコレクション：フィールドから実験室まで

収集ツールの準備：

-GPS機器（取得ポイントを正確に配置）

専門家のおすすめ：ステムのベースを含む、コレクション中に完全な結実ボディを維持してください。多くの重要な識別機能がここにあります。理想的には、複数の発達段階の個人が収集され、完全に成熟するまで傘を開くことはありません。

サンプル保存方法：

-cryo -storage：-20°Cの長期保管の場合、-80°Cベスト

基本的なホーム研究所プログラム：

1. 50〜100mgの乾燥細菌キャップ組織を取り、液体窒素で微粉末に粉砕します。

2. CTAB抽出バッファーを追加し、65°Cで30分間入浴します

3.タンパク質を除去するためのクロロホルム - イソアミルアルコール抽出

4。イソプロパノールはDNAを沈殿させます

5。70％エタノールで洗浄し、TEバッファーに溶解した

コマーシャルキットの選択：初心者向けには、Qiagen Dneasy Plant Mini KitまたはMP Biomedicals fastDnaスピンキットを使用することをお勧めします。成功率は最大95％で、プロセス全体には1〜2時間しかかかりません。

一般的なエラー回避：

標準その増幅スキーム：

シーケンス選択：

###シーケンス分析と識別：データ解釈の技術

基本プロセス：

1。シーケンス品質制御：低品質の領域を削除し、Q値> 30を確保する

2。ブラスト検索：NCBIまたはUniteデータベースの比較

3。類似性評価：> 97-99％類似性は通常、同じ種を示しています

4.系統解析：進化ツリーを構築することにより、識別結果を確認します

実践的なスキル：最高のマッチング結果を盲目的に信じないでください。複数のハイマッチングシーケンスを確認して、その起源と注釈の品質を確認します。 Unite Databaseでは、「種の仮説」数を持つシーケンスが好まれ、専門的に注釈が付けられ、信頼性が高くなります。

##メインデータベースとリソースプラットフォーム

###プロフェッショナルデータベースの比較

Unite Database （https://unite.ut.ee）

genbank （https://www.ncbi.nlm.nih.gov）

大胆なシステム（http://www.boldsystems.org）

###データベースの使用ポリシー

マルチデータベース検証：少なくとも2つの独立したデータベースで重要な認証を確認する必要があります。 UniteとBoldが同じ結果を与えると、信頼性が大幅に改善されます。

シーケンスの品質を評価：

##その他：他の分子マーカーの適用

###補助識別マーキングシステム

LSU（大サブユニットリボソームRNA）：

TEF1-α（翻訳拡張係数）：

RPB2（RNAポリメラーゼの2番目に大きなサブユニット）：

###マルチギーンジョイント分析

困難な識別のために、複数の遺伝子マーカーを組み合わせると精度が大幅に向上します。標準的なマルチゲン分析には、その+LSU+RPB2+TEF1-αが含まれます。この組み合わせは、相対種間の区別においてほぼ100％の成功率を持っています。

##実用アプリケーションシナリオ

###食用キノコの安全性識別

ケーススタディ：北米モレルコンプレックス

伝統的に、北米のコレクターはすべての黒いモラルを同じ種と見なしていました。 DNAバーコードは、これが実際には12種類の種の複合体であることを明らかにしており、その一部は分布範囲が限られており、収集ストレスが局所的な絶滅につながる可能性があります。責任ある専門家コレクターは現在、持続可能な収集を確保するために高価値種のDNA検証を実施しています。

顧客マッシュルーム製品の真正性の確認

臨床検査では、市場にある「野生で収集された」キノコの30％が実際に栽培品種であることがわかりました。 DNAバーコードを使用して、ベンダーの声明の信頼性を検証することができます。特に、松下、モレル、シャンテレスなどの高価値種に適しています。

###環境DNAモニタリング

革新的な技術：土壌、水、または空気から総DNAを抽出し、果物の実体を培養または観察することなく、ハイスループットシーケンスを通じて真菌のコミュニティ組成を分析します。

実用アプリケーション：

屋外操作ガイド：

1. 100〜200gの表面土壌（葉層の除去）を集める

2。滅菌ツールを使用して、相互汚染を避けます

3。すぐに冷蔵するか、ストレージバッファーを追加します

4.正確なGPS座標と環境パラメーターを記録します

###法医学菌学のアプリケーション

有毒なキノコ中毒の場合、DNA分析は嘔吐物、調理、さらには消化器系からの種を特定し、医学的介入の重要な情報を提供することができます。 2019年のカリフォルニア中毒事件では、Amanita PhalloidesがDNAバーコードを介して胃の内容から特定され、医師は実験的解毒剤を使用して患者の命をうまく救うように導かれました。

##ポータブルDNAテクノロジー：フィールドでのリアルタイム識別

###技術的なブレークスルー

オックスフォードナノポアミニオン：

-USB経由でラップトップに接続されているPalmシーケンサー

高速PCRデバイス：

###フィールドワークフロー

1。オンサイトのサンプル収集と録音

2。迅速なDNA抽出（15分）

3。ポータブルPCR増幅（30分）

4。ミニオンシーケンスとリアルタイム分析（1〜4時間）

5。衛星ネットワークを介したデータベースの比較にアクセスします

実践的な経験：モンタナ州の遠隔地での真菌調査では、このシステムを使用して3時間で12のサンプルのオンサイト識別を完了し、従来の方法には数週間かかりました。

##コスト分析とアクセシビリティ

###現在の料金構造

ビジネスサービス（サンプルを送信）：

セルフサービスプラン：

###コストの低下トレンド

DNAシーケンスコストは、過去10年間で2008年のメガベースあたり0.10ドルから2023年の0.0001ドルまで1,000倍減少しました。この傾向は継続され、個々の真菌識別コストは今後5年間で5ドルを下回ると予想されます。

##市民科学参加ガイド

inaturalistプラットフォーム：

1.クリアマッシュルームの写真をアップロードします

2。詳細な収集情報を記録します

3.予備的なコミュニティ評価を取得します

4.高品質の観測値を選択して、DNA分析を提出します

プロのプロジェクト協力：

-NSF資金の「北米の真菌ダイバーシティプロジェクト」

サンプル提出契約：

###成功したケース：北米マッシュルームマッププロジェクト

市民科学者の共同努力を通じて、このプロジェクトは過去5年間に5,000を超える地理的サンプルを収集し、23の新しい真菌種を発見し、23属の分類境界を修正し、真菌の生物ネルギーに対する気候変動の影響に関する重要なデータを提供しました。

##制限と課題

###技術的な制限

不完全なデータベース：

型型突然変異問題：

###実用的な課題

リソース要件：

識別trap ：

##将来の開発の方向

###テクノロジートレンド

全ゲノムシーケンス：

人工知能の統合：

オンサイトテクノロジー：

###標準化と統合

グローバルイニシアチブ：

##実際の操作：初心者から熟練したものまで

###学習パスの提案

ステージ1：基本

ステージ2：スキル開発

ステージ3：プロのアプリケーション

###必要なリソースリスト

学習材料：

実験装置：

-PCRインストゥルメント（$ 1,000〜3,000）

消耗品：

-DNA抽出キット

-PCRプライマーとマスターミックス

##倫理と責任

###コレクション倫理

持続可能な慣行：

データ共有：

###科学と完全性

正確な識別：

DNAバーコードは、伝統的な菌類を置き換えることではなく、それらとの強い相乗効果を形成することです。最も信頼できる識別は、複数の証拠統合から得られます。

包括的な評価契約：

1。フィールドマクロの観察と記録

2。マイクロ機能の検証

3。生態学的および分散データ評価

4。DNAバーコードの確認

5。必要に応じて化学分析を支援しました

**専門家の提案：最先端のDNAテクノロジーを使用しても、形態学的識別スキルの育成を無視しないでください。最高の菌学者は、フィールド観測体験と実験室データをシームレスに組み合わせることができる人です。

##アクションガイド：今すぐ始めましょう

今週のアクションアイテム：

1.一般的な地元のマッシュルームを3つ選択し、詳細な写真を撮ります

2。inaturalistでアカウントを作成し、観察をアップロードします

3.地元の菌​​類協会のDNAバーコードプロジェクトを研究する

4。基本的な真菌分子生物学に関する本を注文します

今月のターゲット：

1.オンラインまたはオフラインのDNAバーコードセミナーに参加します

2。サンプル収集と保存システムを確立します

3.地元の大学のMycology Research Groupにお問い合わせください

4.ホームラボの予算と計画を準備してください

今年のビジョン：

1.少なくとも50種類の在来種DNAバーコードを完成させます

2。市民の科学的発見に関するレポートを公開します

3。個人の参照シーケンスライブラリを作成します

4。DNAバーコードテクノロジーを学ぶために、少なくとも1人を導く

DNAバーコードテクノロジーは、真菌の識別のために民主化されており、かつては神学を真剣に受け止めているすべての人に専門的な研究所に限定される能力を与えています。このテクノロジーは急速に発展しており、コストは削減され続け、アクセシビリティが増加しています。今こそ、DNAバーコードを菌類の実践に統合するのに最適な時期です。

目標は、自然な観察の喜びを技術に置き換えることではなく、真菌王国とのつながりを深め、識別の自信を高め、世界の真菌知識システムに貢献することです。慎重に収集され、慎重に記録され、正確に特定されたすべてのサンプルは、科学への貴重な貢献です。