03 Technologie de code-barres ADN
Le concept de code-barres d'ADN est similaire à la balayage des produits de base du supermarché: identifier les espèces en analysant les séquences dans des régions spécifiques d'ADN biologique.Pour les champignons, la région de code-barres standard reconnue internationalement est son (espaceur transcriptionnel interne).Cette technologie résout non seulement le problème qui a tourmenté les mycologues depuis des décennies, mais fournit également des outils sans précédent précis pour les collectionneurs de terrain, les chefs et les chercheurs.
Il est situé entre le gène 18S-5.8S-28S d'ADN ribosomal et contient deux espaceurs: ITS1 et ITS2.La sélection de la région à barres standard fongique est basée sur quatre avantages clés:
Variation idéale : La région ITS a une différence suffisamment grande entre les espèces pour distinguer les espèces relatives, tandis que la variation intraspécifique est relativement faible, garantissant que les séquences individuelles de la même espèce sont essentiellement cohérentes.Les données réelles montrent que la région ITS varie entre les espèces de 3 à 15% dans la plupart des populations fongiques, tandis que la variation intraspécifique est généralement inférieure à 1 à 2%.
Les amorces générales : Les chercheurs ont développé plusieurs paires d'amorces universelles (comme ITS1 / ITS4, ITS5 / ITS4) qui peuvent amplifier les régions de la grande majorité des populations fongiques sans avoir besoin de concevoir des amorces spécifiques pour chaque espèce.
Domain Rich : Les mycologues du monde entier ont construit conjointement des bases de données contenant des millions de ses séquences, telles que Unite, Genbank et Bold Systems, fournissant une base solide pour la comparaison et l'identification.
Facile à amplifier : la région ITS a une longueur modérée (généralement 500-700 paires de bases), et le taux de réussite de l'amplification par PCR est élevé, et les séquences disponibles peuvent être obtenues même à partir d'échantillons dégradés.
Dans le nord-ouest du Pacifique, les collectionneurs ont utilisé un Amanita blanche comme espèce comestible pendant de nombreuses années jusqu'à ce que le code-barres ADN ait révélé qu'il s'agissait en fait d'une nouvelle espèce proche du capuchon de mort (Amanita Phalloides).Cette découverte peut avoir empêché de nombreux incidents d'empoisonnement.Grâce à son analyse de séquence, les chercheurs ont constaté que ce champignon était différent de 8,7% de l'Amanita comestible connu, qui était beaucoup plus élevée que le seuil de distinction de qualité espèce (généralement 3%).
Préparation des outils de collecte :
- Gants stériles (prévenir la contamination croisée)
- Sac à échantillonnage stérile ou sac en papier
- réfrigérateur portable (maintien de l'intégrité de l'ADN)
- Équipement GPS (positionner avec précision le point d'acquisition)
- Caméra numérique (enregistre les fonctionnalités macro en détail)
- Livre de disques sur place (Habitat d'enregistrement, hĂ´te, odeur, etc.)
Les experts recommandent : Assurez-vous de garder le corps de fructification complet pendant la collection, y compris la base de la tige - de nombreuses caractéristiques d'identification clés sont situées ici.Idéalement, les individus de plusieurs étapes de développement sont collectés, sans jamais ouvrir un parapluie jusqu'à ce qu'ils soient pleinement matures.
MĂ©thode d'Ă©conomie d'Ă©chantillonnage :
- Méthode de séchage en gel de silicone: Mettez des échantillons frais dans un récipient scellé et mélangez-les avec des particules de silicone et sèche complètement en 48 heures
-Cryo-Storage: -20 ° C pour le stockage à long terme, -80 ° C
- Préservation de l'éthanol: l'éthanol à 95% convient à la recherche moléculaire, mais il détruira les caractéristiques morphologiques
Programme de laboratoire de base ::
1. Prenez 50 à 100 mg de tissu bactérien séché et broyez-le en poudre fine avec de l'azote liquide.
2. Ajouter le tampon d'extraction CTAB et se baigner en 65 ° C pendant 30 minutes
3. Extraction d'alcool chloroforme-isoamyl pour éliminer les protéines
4. L'isopropanol précipite l'ADN
5. Lavé avec de l'éthanol à 70% et dissous dans un tampon TE
Sélection du kit commercial : Pour les débutants, il est recommandé d'utiliser Qiagen Dneasy Plant Mini Kit ou MP Biomedicals FastDNA Spin Kit, avec un taux de réussite jusqu'à 95%, et l'ensemble du processus ne prend que 1 à 2 heures.
Évitement des erreurs courantes :
- Évitez d'utiliser des échantillons périmés ou dégradés
- Empêcher la contamination de l'ADN exogène (établi, stérilisation de l'outil)
- Ne pas sur-dérive et ne provoquez pas la rupture de l'ADN
standard son schéma d'amplification :
- SĂ©lection d'amorce: ITS1F (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3 ') et ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')
- Système de réaction: 25 μL de volume total, contenant environ 10 à 50 ng de modèle ADN
- Conditions de cycle: prédénaturation 94 ° C pendant 4 minutes; 35 cycles (94 ° C 30 secondes, 52 ° C 30 secondes, 72 ° C 45 secondes); Extension finale de 72 ° C pendant 7 minutes
Sélection de séquençage :
- Sequençage Sanger: échantillon unique, coûte environ 10-15 $, temps de revirement 1 à 3 jours
- Séquençage à haut débit: adapté aux échantillons environnementaux ou à l'identification par lots, le coût dépend du débit
Processus de base :
1. Contrôle de la qualité de la séquence: supprimer les zones de faible qualité et assurer la valeur Q> 30
2. Recherche de souffle: comparaison dans les bases de données NCBI ou Unite
3. Évaluation de la similitude:> 97-99% La similitude indique généralement la même espèce
4. Analyse phylogénétique: confirmer les résultats d'identification en construisant l'arbre d'évolution
Compétences pratiques : Ne croyez pas aveuglément au résultat correspondant le plus élevé.Vérifiez plusieurs séquences de forte correspondance pour voir leurs origines et leur qualité d'annotation.Dans les bases de données Unite, les séquences avec des nombres d'hypothèses "d'espèces" sont préférées, qui sont annotées professionnellement et ont une fiabilité plus élevée.
Unite Database (https://unite.ut.ee)
- Conçu spécifiquement pour les fongiques de ses séquences
- Fournit un système d'hypothèse (SH) pour réduire l'identification des erreurs
- Recommandé comme la principale ressource d'identification
Genbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)
- Base de données complète contenant toutes les séquences biologiques
- Le volume de données est important mais la qualité est différente, vous devez donc l'utiliser avec prudence
- Meilleur effet en combinaison avec des outils de souffle
BOLD SYSTEM (http://www.boldsystems.org)
- Conçu spécifiquement pour les codes à barres ADN
- Intégrer les données morphologiques et moléculaires
- Interface conviviale, adaptée aux débutants
Vérification multi-database : L'authentification importante doit être confirmée dans au moins deux bases de données indépendantes. Si Unite et Bold donnent les mêmes résultats, la crédibilité est considérablement améliorée.
Évaluer la qualité des séquences :
- Vérifiez la longueur de la séquence (sa superficie doit être> 500 pb)
- Confirmer la crédibilité de la soumissionuse (Organisation de recherche vs utilisateurs non vérifiés)
- Voir le soutien de la littérature publiée pertinente
LSU (grande sous-unité ribosomal ARN) :
- Convient pour la classification des unités de classification au-dessus du niveau
- Le taux d'évolution est lent, adapté à une recherche sur les relations lointaines
- particulièrement utilisé pour la levure et l'identification microfungal
TEF1-α (facteur d'extension de traduction) :
- Résolution au niveau de l'espèce plus élevée dans certains groupes tels que l'orchidée orchidée
- Résolvez le problème des proches parents qui ne peuvent pas distinguer
- Besoin d'amorces spécifiques au groupe
RPB2 (deuxième plus grande sous-unité d'ARN polymérase) :
- L'un des marqueurs préférés de la recherche phylogénétique
- fournit des signaux évolutifs différents de son
- couramment utilisé pour la révision du système de classification
Pour une identification difficile, la combinaison de plusieurs marqueurs de gènes améliore considérablement la précision.L'analyse multigène standard comprend son + LSU + RPB2 + TEF1-α, et cette combinaison a un taux de réussite de près de 100% dans la distinction entre les espèces relatives.
Étude de cas: North American Morel Complex
Traditionnellement, les collectionneurs nord-américains considèrent toutes les morilles noires comme la même espèce.Le code-barres d'ADN révèle qu'il s'agit en fait d'un complexe de 12 espèces différentes, dont certaines ont des gammes de distribution limitées et le stress de collecte peut conduire à l'extinction locale.Les collectionneurs responsables et professionnels effectuent désormais une validation ADN des espèces de grande valeur pour assurer une collecte durable.
Vérification de l'authenticité du produit des champignons
Les tests de laboratoire ont révélé que 30% des champignons "sauvages" sur le marché sont en fait des cultivars.À l'aide de codes à barres ADN, nous sommes en mesure de vérifier l'authenticité de la déclaration du fournisseur.Particulièrement adapté aux espèces de grande valeur telles que Matsutake, Morel et Chanterelles.
Technologie révolutionnaire : Extraire l'ADN total du sol, de l'eau ou de l'air, analyser la composition de la communauté fongique par le séquençage à haut débit sans cultiver ou observer les entités fruitières.
Application pratique :
- Surveillance des changements dans la distribution des espèces menacées
- Détection précoce des espèces fongiques envahissantes
- Évaluation de la santé des écosystèmes forestiers
- suivre l'impact du changement climatique sur les communautés fongiques
Guide de fonctionnement en plein air :
1. Collectez 100-200 g de sol de surface (Ă©limination de la couche de feuille)
2. Utilisez des outils stériles pour éviter la contamination croisée
3. Réfrigérer immédiatement ou ajouter un tampon de stockage
4. Enregistrer les coordonnées GPS précises et les paramètres environnementaux
Dans les cas d'empoisonnement toxique des champignons, l'analyse de l'ADN peut identifier les espèces de vomissements, de résidus de cuisson et même du système digestif, fournissant des informations clés pour les interventions médicales.Dans un incident d'empoisonnement en Californie de 2019, les phalloides Amanita ont été identifiés à partir du contenu de l'estomac par le biais de codes à barres d'ADN, et les médecins ont été guidés pour utiliser des antidotes expérimentaux pour sauver avec succès la vie des patients.
Oxford Nanopore Minion :
- séquenceur de palmier, connecté à un ordinateur portable via USB
- séquençage en temps réel, l'acquisition de données commence dans quelques minutes après la préparation des échantillons
- Convient aux postes de travail en plein air
- Coût: kit de démarrage d'environ 1 000 $, le coût par séquençage continue de baisser
Dispositif PCR rapide :
- Instrument PCR portable, alimentaire Ă batterie
- Expansion complète dans les 30 minutes
- Connectez-vous avec les applications de smartphone pour simplifier les processus opérationnels
1. Collection et enregistrement des Ă©chantillons sur place
2. Extraction rapide de l'ADN (15 minutes)
3. Amplification PCR portable (30 minutes)
4. Séquençage de Minion et analyse en temps réel (1 à 4 heures)
5. Comparaison de la base de données d'accès via le réseau satellite
Expérience pratique : Dans une enquête fongique dans les zones éloignées du Montana, nous avons utilisé ce système pour compléter l'identification sur place de 12 échantillons en 3 heures, et la méthode traditionnelle a pris plusieurs semaines.
Service commercial (Envoyer un Ă©chantillon):
- Séquençage Sanger unique: 15-40 $
- Préparation des échantillons + séquençage: 50 à 100 $
- Séquençage à haut débit (par échantillon): 10-25 $ (par lots)
Plan de libre-service :
- Investissement initial dans l'équipement de laboratoire: 5 000 à 10 000 $ (y compris les instruments de PCR, l'équipement d'électrophorèse, etc.)
- Coût des consommables par réaction: 5-15 $
- Coopération universitaire: de nombreuses institutions de recherche acceptent les échantillons de sciences des citoyens, avec des coûts nettement inférieurs
Les coûts de séquençage d'ADN ont chuté de 1 000 fois au cours de la dernière décennie, passant de 0,10 $ par mégabase en 2008 à 0,0001 $ en 2023. Cette tendance se poursuit, et les coûts d'identification fongique individuels devraient baisser en dessous de 5 $ par temps au cours des cinq prochaines années.
Plateforme inaturaliste :
1. Télécharger des photos de champignons clairs
2. Enregistrer les informations de collecte détaillées
3. Obtenir une évaluation communautaire préliminaire
4. Sélectionnez des observations de haute qualité pour soumettre l'analyse d'ADN
Coopération professionnelle du projet :
- «Projet de diversité fongique nord-américaine financée par la NSF»
- Recherche spéciale sur les sociétés fongiques à divers endroits
- Citizen Science Program of University Research Team
Exemple de contrat de soumission :
- Contactez le chercheur pour confirmer les intérêts et les besoins
- Suivez le guide de collection et de préservation des échantillons
- Fournir des données détaillées sur place et des photos de haute qualité
- Acceptez le partage et la publication des données
Grâce aux efforts conjoints des scientifiques citoyens, le projet a collecté plus de 5 000 échantillons de géoréférence au cours des cinq dernières années, a découvert 23 nouvelles espèces fongiques, révisé les limites de classification de 23 genres et fourni des données clés sur l'impact du changement climatique sur la phénologie fongique.
Base de données incomplète :
- On estime que seulement 10 à 15% des espèces fongiques ont des séquences de référence
- Foulgi tropicaux et souterrains sérieusement sous-représentés
- La séquence de commentaires d'erreur pollue la base de données
Problème de mutation intra-de type :
- Ses variantes sont importantes dans certains groupes (comme les champignons ectomycorhiziens)
- Le code-barres unique ne peut pas distinguer toutes les espèces
- Une confirmation de marqueur moléculaire supplémentaire est requise
Exigences de ressources :
- Le seuil technique initial est élevé
- Des connaissances de base de la biologie moléculaire sont nécessaires
- Le risque de contamination des Ă©chantillons existe toujours
Trap d'identification :
- Blind Trust Database Mosting Matching
- Ignorer la forme et les données écologiques
- surexplication des résultats négatifs
Séquençage du génome entier :
- Les coûts continuent de diminuer, plus de référence génomique
- Fournit beaucoup d'informations bien au-delĂ du code-barres
- résoudre des problèmes de classification complexes
Intégration de l'intelligence artificielle :
- Analyse automatique des séquences automatique et contrôle de la qualité
- Reconnaissance d'images + Identification conjointe des données d'ADN
- Modélisation de la distribution prédictive
Technologie sur place :
- Dispositif de séquençage portable de la connexion du smartphone
- Accès et comparaison de la base de données en temps réel
- Collection guidée de l'interface de réalité augmentée
Initiative mondiale :
- Méthodes de code-barres unifiées et normes de données
- Système de certification de qualité de séquence de référence
- plate-forme d'intégration des données morphologiques et moléculaires
Étape 1: Bases
- Cours de biologie moléculaire en ligne (Coursera, EDX)
- Ateliers locaux de l'association des champignons
- Formation de base de la sécurité en laboratoire
Étape 2: Développement des compétences
- Participer Ă l'atelier de formation des codes Ă barres ADN
- Les bénévoles participent à des projets de recherche
- Établir des capacités de base dans les laboratoires à domicile
Étape 3: Application professionnelle
- Effectuer des projets de recherche personnelle
- Publier des découvertes scientifiques citoyennes
- Guide la nouvelle génération d'amants de champignons
Matériel d'étude :
- "Systèmes moléculaires fongiques" (manuel)
- "Code Ă barres ADN: principes et applications"
- Guide d'identification des champignons inaturalistes
Équipement de laboratoire :
- Microcentrifugeuse (200-500 $)
- Instrument PCR (1 000 Ă 3 000 $)
- Équipement d'électrophorèse (200-500 $)
- Pipepter Set (300-600 $)
Consommables:
- kit d'extraction d'ADN
- amorces de PCR et mélange de maître
- tampon d'agarose et d'électrophorèse
- Consommables stériles (tubes, têtes d'aspiration, etc.)
Pratique durable :
- Respectez les réglementations et limites de collecte locales
- Évitez les espèces rares et menacées
- Le volume de collecte ne dépasse pas 1/3 de la communauté
- Enregistrer et signaler une découverte anormale
Partage de données :
- Soumettre des séquences de haute qualité aux bases de données publiques
- Étiquetage précis des informations et identification de la collecte
- Respecter les connaissances et les droits des peuples autochtones
Identification précise :
- Aucune exagération de l'importance de la découverte
- Reconnaître l'incertitude de l'identification
- Cherchez des échantillons difficiles à vérification des pairs
- Données et identification erronées correctes
Les codes à barres ADN ne consistent pas à remplacer la mycologie traditionnelle, mais à former une forte synergie avec eux.L'identification la plus fiable provient de l'intégration de preuves multiples:
Accord d'Ă©valuation complet :
1. Observation et enregistrement de macro de champ
2. Vérification des caractéristiques micro
3. Évaluation des données écologiques et distribuées
4. Confirmation de code-barres ADN
5. Aidé à l'analyse chimique si nécessaire
** Les experts suggèrent: même avec la technologie ADN la plus avancée, n'ignorez pas la culture de vos compétences d'identification morphologique.Les meilleurs mycologues sont ceux qui peuvent combiner parfaitement une expérience d'observation sur le terrain avec les données de laboratoire.
Articles d'action de la semaine :
1. Choisissez 3 champignons locaux communs et prenez des photos détaillées
2. Créez un compte dans Inaturalist et téléchargez une observation
3. Étudiez le projet de code-barres ADN de la Société des champignons locaux
4. Commandez des livres sur la biologie moléculaire des champignons de base
Target pour ce mois :
1. Participez aux séminaires de code-barres ADN en ligne ou hors ligne
2. Établir un système de collecte et de préservation des échantillons
3. Contactez le groupe de recherche de la mycologie de l'Université locale
4. Préparez votre budget et planifiez votre laboratoire à domicile
Vision de l'année :
1. Compléter au moins 50 codes à barres d'ADN des espèces indigènes
2. Publier un rapport sur les découvertes scientifiques des citoyens
3. Créez une bibliothèque de séquences de référence personnelle
4. Guide au moins une personne pour apprendre la technologie de code-barres ADN
La technologie de code-barres ADN a été démocratisée pour l'identification des champignons, donnant les capacités autrefois limitées aux laboratoires professionnels à tous ceux qui prennent la myologie au sérieux.Cette technologie se développe rapidement, les coûts continuent de diminuer et l'augmentation de l'accessibilité.C'est le moment idéal pour apprendre en profondeur et intégrer le code-barres ADN dans votre pratique de mycologie.
N'oubliez pas que l'objectif n'est pas de remplacer le plaisir de l'observation naturelle par la technologie, mais d'approfondir notre connexion avec le royaume fongique, d'améliorer notre confiance d'identification et de contribuer au système mondial de connaissances fongiques.Chaque échantillon soigneusement prélevé, soigneusement enregistré et identifié avec précision est une contribution précieuse à la science.