03 Tecnología de código de barras de ADN

El concepto de código de barras de ADN es similar al escaneo de productos básicos de supermercados: identificando especies analizando secuencias en regiones específicas de ADN biológico.Para los hongos, la región de código de barras estándar reconocida internacionalmente es su (espaciador transcripcional interno).Esta tecnología no solo resuelve el problema que ha afectado a los micólogos durante décadas, sino que también proporciona herramientas sin precisas para recolectores de campo, chefs e investigadores.

Se encuentra entre el gen 18S-5.8S-28S de ADN ribosómico y contiene dos espaciadores: ITS1 e ITS2.Seleccionar su región de código de barras estándar de hongos se basa en cuatro ventajas clave:

Variación ideal : La región IT tiene una diferencia lo suficientemente grande entre las especies para distinguir entre especies relativas, mientras que la variación intraespecies es relativamente pequeña, lo que garantiza que las secuencias individuales de la misma especie sean básicamente consistentes.Los datos reales muestran que la región IT varía entre especies en un 3-15% en la mayoría de las poblaciones fúngicas, mientras que la variación intraespecies suele ser inferior al 1-2%.

Cebadores generales : Los investigadores han desarrollado múltiples pares de cebadores universales (como ITS1/ITS4, ITS5/ITS4) que pueden amplificar sus regiones de la gran mayoría de las poblaciones fúngicas sin la necesidad de diseñar cebadores específicos para cada especie.

Rich de dominio : los micólogos de todo el mundo han construido conjuntamente bases de datos que contienen millones de sus secuencias, como Unite, GenBank y Bold Systems, proporcionando una base sólida para la comparación e identificación.

Fácil de amplificar : La región ITS tiene una longitud moderada (generalmente 500-700 pares de bases), y la tasa de éxito de amplificación por PCR es alta, y las secuencias disponibles se pueden obtener incluso de muestras degradadas.

En el noroeste del Pacífico, los coleccionistas usaron una Amanita blanca como especie comestible durante muchos años hasta que el código de barras de ADN reveló que en realidad era una nueva especie cercana a la tapa de la muerte (Amanita phalloides).Este descubrimiento puede haber evitado numerosos incidentes de envenenamiento.A través de su análisis de secuencia, los investigadores encontraron que este hongo era 8.7% diferente de la amanita comestible conocida, que era mucho más alta que el umbral de distinción de grado de especies (generalmente 3%).

Preparación de la herramienta de recolección :

Los expertos recomiendan : Asegúrese de mantener el cuerpo de fructificación completo durante la recolección, incluida la base del tallo: muchas características de identificación clave se encuentran aquí.Idealmente, se recolectan individuos de múltiples etapas de desarrollo, que nunca abren un paraguas hasta que están completamente maduros.

Método de ahorro de muestra :

-Cryo -Storage: -20 ° C para almacenamiento a largo plazo, -80 ° C mejor

Programa básico de laboratorio en el hogar :

1. Tome 50-100 mg de tejido de tapa bacteriana seca y muele en polvo fino con nitrógeno líquido.

2. Agregue el tampón de extracción CTAB y bañe en 65 ° C durante 30 minutos

3. Extracción de alcohol isoamílico de cloroformo para eliminar la proteína

4. El isopropanol precipita el ADN

5. Lavado con etanol al 70% y disuelto en tampón TE

Selección del kit comercial : Para principiantes, se recomienda usar el mini kit de plantas DNeasy de Qiagen o el kit de spin de ADNmt Biomedicals de MP, con una tasa de éxito de hasta el 95%, y todo el proceso solo lleva 1-2 horas.

Evitación de error común :

Estándar su esquema de amplificación :

-Selección de cebadores: ITS1F (5'-CTTGGTCATTTAGAGAGAAGTAA-3 ') e ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATGC-3'))

Selección de secuenciación :

-Sugencia de Sanger: muestra única, cuesta aproximadamente $ 10-15, tiempo de respuesta 1-3 días

Proceso básico :

1. Control de calidad de secuencia: elimine las áreas de baja calidad y asegúrese de Q valor> 30

2. Búsqueda de explosión: comparación en NCBI o bases de datos unitarias

3. Evaluación de similitud:> 97-99% La similitud generalmente indica la misma especie

4. Análisis filogenético: confirme los resultados de identificación construyendo el árbol de evolución

Habilidades prácticas : No creas ciegamente en el resultado más alto en coincidencia. Verifique múltiples secuencias de alto partido para ver sus orígenes y calidad de anotación.En las bases de datos de unite, se prefieren las secuencias con números de "hipótesis de especies", que se anotan profesionalmente y tienen una mayor confiabilidad.

Unite la base de datos (https://unite.ut.ee)

GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)

Sistema en negrita (http://www.boldsystems.org)

VERIFICACIÓN MULTI-DATABASE : La autenticación importante debe confirmarse en al menos dos bases de datos independientes. Si Unite y Bold dan los mismos resultados, la credibilidad mejora enormemente.

Evaluar la calidad de la secuencia :

LSU (ARN ribosómico de subunidad grande) :

TEF1-α (factor de extensión de traducción) :

RPB2 (segunda subunidad más grande de ARN polimerasa) :

Para una identificación difícil, combinar múltiples marcadores de genes mejora en gran medida la precisión.El análisis multigeno estándar incluye su+LSU+RPB2+TEF1-α, y esta combinación tiene una tasa de éxito de casi el 100% en la distinción entre especies relativas.

Estudio de caso: Complejo Morel de América del Norte

Tradicionalmente, los coleccionistas de América del Norte ven a todas las morillas negras como la misma especie.El código de barras de ADN revela que este es en realidad un complejo de 12 especies diferentes, algunas de las cuales tienen rangos de distribución limitados y el estrés de recolección puede conducir a la extinción local.Los coleccionistas responsables y profesionales ahora realizan la validación de ADN de especies de alto valor para garantizar una recolección sostenible.

Verificación de autenticidad del producto de hongos del cliente

Las pruebas de laboratorio encontraron que el 30% de los hongos "recolectados salvajes" en el mercado son en realidad cultivares.Usando códigos de barras de ADN, podemos verificar la autenticidad de la declaración del proveedor.Especialmente adecuado para especies de alto valor como Matsutake, Morel y Chanterelles.

Tecnología revolucionaria : Extraiga el ADN total del suelo, el agua o el aire, analice la composición de la comunidad fúngica a través de la secuenciación de alto rendimiento sin cultivar ni observar entidades de frutas.

Aplicación práctica :

Guía de operación al aire libre :

1. Recoge 100-200 g de suelo superficial (eliminación de la capa de hoja)

2. Use herramientas estériles para evitar la contaminación cruzada

3. Refrigere inmediatamente o agregue el búfer de almacenamiento

4. Registro de coordenadas GPS precisas y parámetros ambientales

En casos de envenenamiento venenoso de hongos, el análisis de ADN puede identificar especies de vómito, residuos de cocción e incluso el sistema digestivo, proporcionando información clave para las intervenciones médicas.En un incidente de envenenamiento de California en 2019, Amanita Phalloides se identificó a partir del contenido del estómago a través de códigos de barras de ADN, y los médicos fueron guiados para usar antídotos experimentales para salvar con éxito la vida de los pacientes.

Oxford Nanopore Minion :

Dispositivo de PCR rápido :

1. Colección y grabación de muestras en el sitio

2. Extracción rápida de ADN (15 minutos)

3. Amplificación de PCR portátil (30 minutos)

4. Secuenciación de Minion y análisis en tiempo real (1-4 horas)

5. Accede a la comparación de la base de datos a través de la red satelital

Experiencia práctica : En una encuesta de hongos en áreas remotas de Montana, utilizamos este sistema para completar la identificación en el sitio de 12 muestras en 3 horas, y el método tradicional tomó varias semanas.

Servicio comercial (enviar muestra):

-Secuenciación de alto rendimiento (por muestra): $ 10-25 (en lotes)

Plan de autoservicio :

Los costos de secuenciación de ADN se han reducido en 1,000 veces durante la última década, de $ 0.10 por megabase en 2008 a $ 0.0001 en 2023. Esta tendencia continúa, y se espera que los costos de identificación de hongos individuales disminuyan por debajo de $ 5 por tiempo en los próximos cinco años.

Plataforma inaturalista :

1. Sube fotos de hongos transparentes

2. Registre información detallada de la recopilación

3. Obtenga la evaluación de la comunidad preliminar

4. Seleccione Observaciones de alta calidad para enviar análisis de ADN

Cooperación de proyectos profesionales :

Acuerdo de presentación de muestra :

-Proporcionar datos detallados en el sitio y fotos de alta calidad

A través de los esfuerzos conjuntos de los científicos ciudadanos, el proyecto ha recopilado más de 5,000 muestras de georreferencia en los últimos cinco años, descubrió 23 nuevas especies fúngicas, revisó los límites de clasificación de 23 géneros y proporcionó datos clave sobre el impacto del cambio climático en la fenología fúngica.

Base de datos incompleta :

Problema de mutación de tipo intra :

Requisitos de recursos :

Trap de identificación :

Secuenciación de genoma completo :

Integración de inteligencia artificial :

Tecnología en el sitio :

Iniciativa global :

Etapa 1: Conceptos básicos

Etapa 2: Desarrollo de habilidades

Etapa 3: Aplicación profesional

Materiales de estudio :

Equipo de laboratorio:

Consumibles :

Práctica sostenible :

Compartir datos :

Identificación precisa :

Los códigos de barras de ADN no se trata de reemplazar la micología tradicional, sino de formar una fuerte sinergia con ellos.La identificación más confiable proviene de la integración de evidencia múltiple:

Acuerdo de evaluación integral :

1. Observación y grabación de la macro de campo

2. Verificación de micro características

3. Evaluación de datos ecológicos y distribuidos

4. Confirmación de código de barras de ADN

5. Ayuda con el análisis químico si es necesario

** Los expertos sugieren: incluso con la tecnología de ADN más avanzada, no ignore el cultivo de sus habilidades de identificación morfológica.Los mejores micólogos son aquellos que pueden combinar sin problemas la experiencia de observación de campo con datos de laboratorio.

Artículos de acción de la semana :

1. Elija 3 hongos locales comunes y tome fotos detalladas

2. Cree una cuenta en inaturalista y cargue una observación

3. Estudie el proyecto de código de barras de ADN de la sociedad de hongos locales

4. Ordene libros sobre hongos básicos biología molecular

Objetivo para este mes :

1. Participe en seminarios de código de barras de ADN en línea o fuera de línea

2. Establecer un sistema de recolección y preservación de muestras

3. Póngase en contacto con el Grupo de Investigación de Micología de la Universidad Local

4. Prepare su presupuesto y plan de laboratorio en casa

Visión del año :

1. Complete al menos 50 códigos de barras de ADN de especies nativas

2. Publique un informe sobre descubrimientos científicos de ciudadanos

3. Cree una biblioteca de secuencia de referencia personal

4. Guíe al menos una persona para aprender tecnología de código de barras de ADN

La tecnología de código de barras de ADN ha sido democratizada para la identificación de hongos, dando las capacidades una vez limitadas a laboratorios profesionales a todos los que toman en serio la miología.Esta tecnología se está desarrollando rápidamente, y los costos continúan disminuyendo y el aumento de la accesibilidad.Ahora es el momento perfecto para aprender en profundidad e integrar el código de barras de ADN en su práctica de micología.

Recuerde, el objetivo no es reemplazar el placer de la observación natural con la tecnología, sino profundizar nuestra conexión con el reino fúngico, mejorar nuestra confianza de identificación y contribuir al sistema global de conocimiento fúngico.Cada muestra cuidadosamente recolectada, cuidadosamente registrada e identificada con precisión es una valiosa contribución a la ciencia.